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よくある技術的問題

問題が解決しない場合は、当方の技術サポートチームまでお問い合わせください。

お問い合わせ

1. 抗体の保管温度は低いほど良いのですか?


抗体の保管は、原則として以下を推奨します:

1、遠心

抗体を受け取ると、4℃、12000rpmで 3 分間遠心し、蓋を開けて小分けし、溶解して保管します(抗体の体積が 50µlを越える場合は、すべての抗体と組み換えタンパク質が均等になるように、遠心時間を 5 分間にしてください。

2、長期保存

大多数の抗体は、-20℃で保管してかまいません;

小分けした抗体はできるだけ融解と凍結の繰り返しを避け、抗体の活性を損なわないようにします。何度も同じチューブから抗体を吸い取らないようにして、汚染の可能性を小さくしてください;

一回の実験で使い切れる量に小分けするのが望ましく、最低でも一回10ulとします。小分け量の体積が小さいほど、抗体の濃度は蒸発や管壁吸着の影響を受けやすくなります;

融解後小分けした抗体を一回で使い切らなかった場合は、残った母液を4℃で保管して、再凍結しないようにしてください;

抗体作動液は調合した日に使い切るようにし、4℃ にしてできるだけ翌日に持ち越さないでください。

抗体は絶対に自動除霜冷蔵庫に入れないでください。抗体をできるだけ冷蔵庫のドアではなく内部に入れ、温度変化により融解と凍結が繰り返されることがないように注意してください。

3、短期保存

大部分の抗体は受け取った後4℃で1-2週間保管しても、抗体の活性に影響はありません;

抗体を短期間(1-2週間)で使用する場合は、4℃での保管を推奨します。融解と凍結を繰り返して抗体の活性を損なわないようにするためです;

長期保管する場合は、-20℃が望ましく、説明書で推奨された方法で正しく抗体を保管することが重要です;

腹水形式の製品は受け取った後、直ちに凍結させます。この種の製品には大量のタンパク質酵素が含まれており、4℃で長期間保管すると抗体に分解が起こります。

4、輸送

通常、輸送は 1-2 週間かかるため、4℃の低温で行います。

4℃で輸送するのは、融解と凍結を繰り返して抗体の活性を損なわないためです。(ドライアイスを使用して輸送し、受け取ったときに抗体が凍結していると、小分けする際に解凍が必要です。この場合、融解と凍結のプロセスが一回多くなるため、輸送中ドライアイスを用いた輸送はしないでください。)

5、特殊抗体の保管条件:

a、酵素結合型抗体:
常に4℃で保管し、凍結を避けます。常に凍結していなければ酵素の活性が低下するか、失われます。

b、カップリング抗体:
すべての複合抗体はブラウンチューブに入れるか、錫箔紙で光を避けて保管します。特に蛍光抗体は、光に極めて敏感なため、すべての実験階段で光を避けて作業する必要があります!

c、igg3のアイソタイプコントロール抗体:
常に4℃で保管し、凍結を避けます。融解すると、この抗体はポリマーを形成します。

注意事項:
保管も輸送も必ず融解と凍結の繰り返しを避けてください!
融解と凍結を繰り返すと抗体に変性が生じ、ポリマーが形成されて、抗体の結合能力が低下します!

2. 抗体の目的タンパク質以外のバンドが目的タンパク質のバンドよりも大幅に太い場合は、どのように目的タンパク質のバンドを特定するのですか?


目的タンパク質のバンド特定:
理論分子量を参照すると、大部分の抗体の検査結果と理論分子量は近接しており、検査結果の誤差は10-15%以内です。従って、正しいバンドと判断できます。目的タンパク質の理論分子量はuniprot上のデータ:http://www.uniprot.org/ を参照できます。一部の抗体の検査結果は理論分子量との差が大きくなります。恐らく次のようなことが原因です:
1、目的タンパク質にグリコシル化修飾などの複数の修飾部位がある。
2、目的タンパク質とその他のタンパク質が体内で安定した複合物を形成した。
3、目的タンパク質が切断された。
4、ubiquitinタンパク質のような個別の特殊なタンパク質
5、ダイマーまたはポリマー

1、グリコシル化修飾の分子量に対する影響

LAMP1を例にとり、下図に自社調製抗体の検査結果を示しました。120KDのバンドと47KDのバンドはともにターゲットバンドです。

Uniprot検索によれはLAMP1の理論分子量は45です:

同時にuniprotにおいて当該タンパク質に複数のグリコシル化修飾部位が存在することが分かります。下図に示します:

目的タンパク質には複数のグリコシル化部位が存在するため、検出バンドが理論分子量から大きく乖離します。当方の推論を証明するために、他社の検出結果を捜しました:

abcamとPTGでも類似する検査結果が得られました。従って、当方の抗体が検出した2つのバンドは間違いなくターゲットバンドです。

2、複合物の分子量に対する影響

ATG5を例にとり、ATG5の検査結果を下図に示しました:

ATG5の理論分子量は32 kDで、グリコシル化修飾はありませんが、ATG12タンパク質と複合物を形成できます:

これらの情報に基づいて、当方が検出したバンドは、ATG5+ATG12のサイズであることが推測できます。他社の検出結果(下図)を参照して以上のデータを総合すると、ATG5で検出された55KDのバンドがターゲットバンドであることが分かります。

3、切断体の分子量サイズに対する影響

LTFを例にとった検出結果は以下の通りです。理論分子量は78で、当方の検出結果は50近くでした:

Uniprotで関連根拠が見つからず、検出結果に疑問がありました。当該タンパク質が加水分解して50と30の二つのバンドができることがあるとの文献を見つけたため、当方が検出したバンドはターゲットバンドでした(This protein has 2 isoforms produced by alternative promoter usage. The human LTF can be isolated two fragments、 an N-terminal tryptic fragment having an Mr of 30 kDa and a C-terminal tryptic fragment having an Mr of 50 kDa by a mild tryptic digest(PMID:3790094))。

3. ABclonal抗体に防腐剤を添加しますか? 抗体の使用效果に影響がありますか?

抗体によく用いる防腐剤はアジ化ナトリウム(NaN3)です。ABclonal正規品、およびPTG、ABcam等にはこの種の防腐剤が多く、この他にチメロサールも用いられます。

作用:アジ化ナトリウムは主に抗体の無菌性を保ち、アジ化ナトリウムは抗体に対して安定した防腐作用があります。アジ化ナトリウムは細菌等微生物の生長を抑え、抗体を安定させます。

アジ化ナトリウムを含む抗体は主にWB、IHC、IF、IP、FCに応用されます。アジ化ナトリウム等を含まない防腐剤は「生物機能検査」や「活細胞研究」に用いられます。例:ある細胞の培養中に抗体を加えてアポトーシスを抑制する、Tリンバ細胞を刺激してCD3 CD28抗体を活性化する等。

注意事項:

HRP標識の二次抗体にアジ化ナトリウムを加えてはいけません。アジ化ナトリウムを加えると着色が抑制されるからです。HRP標識の二次抗体はアジ化ナトリウムの不可逆抑制剤であるため、二次抗体にアジ化ナトリウムを加えてはいけません。但し、一次抗体は通常細胞培養や機能性に係わる実験に使用するのでない限り、通常微量のアジ化ナトリウムが含まれています。

アジ化ナトリウムはHRP二次抗体の活性に影響します。但し、通常のWestern blot実験において、一次抗体は少量のアジ化ナトリウムを含んでいますが、二次抗体になる前に洗浄されるため、後の結果には影響しません。二次抗体以後の手順を考慮する必要があります。一般に商品化されたPBSまたはTBSバッファーはアジ化ナトリウムを含有する可能性があり、これらの製品は購入時にメーカーから提供された説明書を読み、アジ化ナトリウム含有の有無をしなければなりません。

総括すると、防腐剤は細菌等の微生物の生長を抑え、抗体を安定させます。防腐剤を含有している抗体は「生物機能検査」や「活細胞研究」に使用してはならず、HRP標識の二次抗体と直接作用させてはいけません。それ以外の実験には基本的に影響しません。

4. ABclonalの抗体調製にはどれくらいの期間が必要ですか?調製成功率はどれくらいですか?

抗体の調製には概ね4ヶ月が必要です。抗体調製の流れはクローン化—発現—免疫—精製—検査です。

クローン化によりベクター上に鋳型が形成されます。当方はシーケンシングを正しく設定し、設計報告書に基づいて場所を選んで発現ベクターに鋳型を作ります。所要期間は二週間以内です。所要期間の短縮をお望みなら、お客様が鋳型を多めに提供してくだされば(少なくとも15ul)、所要期間を短縮できます。同時に、当方にシーケンシング結果をご提供いただきます。量が不足していると、当方が転写してからシーケンシングを行わなければならず、これに2-3日かかるからです。お客様から発現ベクターをご提供頂ければ、我々はそのまま発現を手配できます。発現は発現ベクター前核を誘導して発現させ、所要期間は2週間以内です。お客様が発現ベクターをご提供くださる場合は、発現条件と発現図を参考として添付していただけますと、当方が発現条件を見つける手間が省けます。免疫期間はウサギで68日、免疫回数は4回です。当方の免疫経験によれば、4次免疫の効果が最も良く、免疫期間を短縮でき、抗体濃度、効能が多少劣っていても、当方が産生する抗体の濃度は通常1.0mg/ml以上で、抗原検査1:1000で少なくとも10ngの抗原タンパク質を検出できます。他社にこのような保証があるでしょうか?お客様が実験をお急ぎなら、お客様の内因性物質検査用に三次免疫の血清を少量取れば、約2週間短縮できます。動物を犧牲にした後、抗体精製検査期間に3週間前後必要です。お客様がお急ぎなら、抗体精製完了後、お客様にPre-test Sampleを送付し、お客様に内因性物質検査をしていただくことが可能です。当方は同時に抗原検査を行い、精製時間は10日前後になります。

当方が調製する抗体は、抗原の検出を保証しており、1:1000に希釈した発現経路抗体で10ngの抗原検出を、ペプチド経路Dot blot実験では1:1000に希釈した抗体で100ngの抗原検出を保証しています。抗原検出が不成功の場合、当方は一切費用も頂きません。ただ、個別のタンパク質またはペプチド本体の性質が劣っている場合には、抗原を検出できません。内因性物質はタンパク質自身の発現量、お客様の作業レベル等で差が出るため、当方が保証することはできません。このリスクはお客様と当方が共に負担する必要があり、内因性物質の検証が不成功の場合、当方は50%の頭金だけをもらい受けて、当方の原価費用とします。当方は長年抗体調製データを分析しており、内因性物質成功率は、発現経路で70%-80%、ペプチド経路ではリスクが若干大きく60%-70%です。